Namens de SIHON Nomenclatuurcommissie en Flowcytometriewerkgroep
F.W.M.B. Preijers1, E.R.
van Wering2, E.G. van Lochem3 *
1. Centraal Hematologisch Laboratorium,
Universitair Medisch Centrum St Radboud, Nijmegen
2. Stichting Kinderoncologie Nederland (SKION),
Den Haag
3. Afdeling Immunologie,
Erasmus Universitair Medisch Centrum Rotterdam, Rotterdam
*mede
namens de overig werkgroepleden van de “3-kleuren-atlas”:
H.H.M.
Eidhof (Twenteborg, Almelo), J. Kraan (ErasmusMC, Rotterdam), M. Leenders (UMC
St Radboud, Nijmegen), A.J. van der Sluijs-Gelling (SKION, Den HAAG), en H.
Wind (Erasmus MC, Rotterdam).
Inleiding
Bloedcellen ontstaan vanuit een pluripotente hematopoïetische stamcel. Via een complex rijpingsproces langs verschillende differentiatielijnen worden uiteindelijk de lymfocyten, monocyten, granulocyten, megakaryocyten en erytrocyten gevormd. Voor een groot deel vindt deze rijping plaats in het beenmerg, behalve van de T-lymfocyten. De T-cel voorlopers (prothymocyten) verlaten al vroeg het beenmerg om in de thymus verder te differentiëren. Beenmerg is een complex hematopoïetisch orgaan met cellen in verschillende differentiatielijnen, die voortdurend bezig zijn te delen en te differentiëren. In gezonde personen zijn vraag en aanmaak van nieuwe bloedcellen stabiel en in evenwicht. Ziekteprocessen, zowel in het beenmerg als elders in het lichaam, kunnen dit evenwicht verstoren met als gevolg dat in één of meer cellijnen kwalitatieve en/of kwantitatieve veranderingen optreden. Zo zal een acute lymfatische leukemie de aanmaak van alle niet-lymfatische cellen gaan verstoren door een ophoping van onrijpe lymfatische cellen. Ook een maligne lymfoom, die initieel in een lymfeklier ontstaat, kan zich verspreiden naar het beenmerg en de hematopoïese ontregelen.
Om binnen de normaal aanwezige
pluriformiteit van het beenmerg afwijkende celpopulaties te kunnen aantonen, is
kennis nodig van afwijkende en normale celpopulatie. Daarnaast zijn technieken
noodzakelijk om de verschillende differentiatiestadia te kunnen vaststellen. De
klassieke cytomorfologie schiet met name
in dat laatste opzicht te kort. Met behulp van immunofenotypering is men
hiertoe in staat dankzij het repertoire aan monoklonale antilichamen (MoAb),
die gericht zijn tegen differentiatieantigenen, in combinatie met de grote
variatie aan fluorochromen en de technische mogelijkheden van de flowcytometer.
Met de flowcytometer kunnen door meting van voorwaartse lichtverstrooiing
(forward scatter; FSC), zijwaartse lichtverstrooiing (side scatter; SSC) en
drie of vier fluorescentiekanalen (in de meest moderne flowcytometers zelfs
vijf en zes) vijf en zes verschillende parameters gelijktijdig binnen één
celmonster bepaald worden. Deze meer-kleuren immuunfluorescentie analyses
hebben grote voordelen ten opzichte van metingen van slechts één kleur. Er is
minder celmateriaal nodig en de tijdsinvestering bij het verwerken is korter.
Bovendien levert dergelijk onderzoek aanzienlijk meer informatie op per
celmonster, omdat de onderlinge relatie van een groter aantal parameters binnen
één celmonster wordt vastgelegd. Daarentegen is het analyseren van de
resultaten ingewikkelder en vraagt meer ervaring met herkenning van
fluorescentie patronen. Het volstaat immers niet om het percentage positiviteit
voor één bepaalde marker vast te stellen, omdat ook de gelijktijdig gemeten
positiviteit of negativiteit voor andere markers uit de MoAb combinatie
essentieel is voor een conclusie. Bovendien geeft de intensiteit van de
fluorescentie-signalen belangrijke informatie voor het definiëren van een
celpopulatie. Dit betekent dat het samenstellen van de MoAb combinaties grote
zorgvuldigheid behoeft. Diverse groepen hebben de laatste jaren hieraan
gewerkt. In Europees verband hebben de laboratoria die participeerden in de
BIOMED-1 Concerted Action een aantal gestandaardiseerde MoAb combinaties
gebruikt voor het analyseren van normaal beenmerg en acute leukemieën1-3.
Binnen Nederland heeft de Nomenclatuurcommissie en de werkgroep Flowcytometrie
van de Stichting Immunofenotypering Hemato-oncologie Nederland (SIHON),
richtlijnen en protocollen geformuleerd voor de immunofenotypering van onrijpe-
en rijpe hematologische maligniteiten. In eerste instantie is gekozen voor
3-kleurencombinaties in plaats van 4-kleuren omdat reeds ruime ervaring met
deze patronen binnen de groep aanwezig was. Daarnaast is de overstap voor laboratoria
van 2- naar 3-kleurenpanels gemakkelijker is dan van 2- naar 4-kleurenpanels.
De combinaties zijn zodanig samengesteld dat de te onderzoeken celpopulatie met
een beperkt aantal 3-kleurencombinaties in twee fasen getest kan worden op
aanwezigheid van een hematologische maligniteit en, zo ja, welke maligniteit
(zie tabel 1).
Tabel 1. Fasen in immunofenotypering van
hematologische maligniteiten met behulp van drie-kleuren MoAb combinaties
van de SIHON. Fase-1: Screening. De differentiatielijn en
rijpheid van een verdachte celpopulatie worden bepaald. De initiële
verdenking en indicatiestelling spelen ook een rol bij de beoordeling van
het resultaat: normaal, reactief of afwijkend, en indien afwijkend, een
onrijpe of rijpe maligniteit. Resultaat:
De screening levert een keuze op voor één van de zes fase-2 panels, of
eindigt met de conclusie dat het normaal of reactief beenmerg dan wel bloed
betreft. Fase-2: Classificatie. De cellijn waarin de
afwijkende populatie zich bevindt als ook het differentiatiestadium worden
verder getypeerd. Resultaat:
Celdefiniëring en subtypering van de afwijkende celpopulatie. Fase-3: Facultatieve patiënt-specifieke kleuring.
Extra kleuringen specifiek voor de betreffende patiënt voor b.v. restziekte
onderzoek of ten behoeve van ander wetenschappelijk onderzoek. Opmerking: Fase-1 dient
bij afwijkende populaties altijd gevolgd te worden door fase-2. Een
conclusie op grond van de resultaten uit fase-1 is meestal onvoldoende voor
een diagnose.
In de eerste fase kan door middel van 7 MoAb-combinaties worden vastgesteld of er een afwijkende populatie aanwezig is; met andere woorden een verdenking op een hematologische maligniteit. De combinaties zijn zodanig uitgebalanceerd dat tevens de cellijn, waarin deze afwijking zich bevindt, vastgesteld wordt. Op basis van deze eerste screening fase kan een meer specifiek panel van MoAb-combinaties worden geselecteerd voor het classificeren van de verdachte populatie. Bij de keuze van het juiste vervolgpanel is het van belang dat uit de eerste fase gebleken is of de maligniteit uit onrijpe of rijpe cellen bestaat en of deze zich in de T-, B- of myeloide cellijn manifesteert. Dit betekent dat gekozen kan worden uit zes maturatie- en cellijn-specifieke panels.
De schema’s van de
3-kleurencombinaties voor onrijpe en rijpe hematologische maligniteiten zijn weergegeven in
Figuur 1 en 2.
Bij de analyse van de metingen
spelen herkenning van marker expressiepatronen een grote rol. Hierbij dienen de
expressiepatronen van de betreffende markers van normaal beenmerg of bloed
vergeleken te worden met die van het te testen beenmerg of bloedmonster.
Hierdoor kunnen de eventuele immuunfenotypische aberranties zichtbaar worden.
Voor deze vergelijking is het
noodzakelijk de immunofenotypering uit te voeren op vol beenmerg of vol bloed.
Bewerking van deze materialen door bijvoorbeeld een gradiëntscheiding, kunnen
een selectief verlies van bepaalde celpopulaties bewerkstelligen, waardoor deze
niet meer binnen het analyse venster vallen en expressiepatronen beïnvloed
worden.
In de bijbehorende atlas zijn
karakteristieke dotplots weergegeven met differentiatiepatronen van de
verschillende cellijnen in normaal beenmerg zoals gevonden kunnen worden met de
MoAb combinaties van de screeningsfase (fase-1). Tegen deze normale achtergrond
zijn representatieve kleuringen van verschillende onrijpe en rijpe
hematologische maligniteiten getoond. Daarnaast zijn praktische richtlijnen
voor een optimale analyse gegeven.
Bij de keuze van de combinaties
van MoAb en fluorochromen is rekening gehouden met beschikbaarheid van MoAbs en
met de variatie in sterkte van bepaalde MoAb-fluorochroom conjugaten. Daarnaast
zijn de combinaties zo gekozen dat ze op iedere flowcytometer te meten zijn.
MoAb-combinaties zijn zo samengesteld dat in het derde fluorescentie-kanaal (FL-3; PE-Cy5 of PerCP geconjugeerd) een algemene (b.v. de leukocytenmarker CD45) of cellijn-definiërende marker valt (b.v. CD19 voor de B-cellijn of CD3 voor de T-cellijn). In het eerste (FL-1) en tweede (FL-2) kanaal zijn markers geplaatst voor complementaire celpopulaties (b.v. CD4 en CD8) of markers waarmee de ontwikkeling binnen een cellijn kan worden uitgezocht (b.v. CD10 en CD20). MoAb met een lagere affiniteit of gericht tegen antigenen met een zwakkere expressie zijn, waar mogelijk, als PE-conjugaat (FL-2) in de antilichaamcombinatie opgenomen omdat dit fluorochroom een sterkere fluorescentie intensiteit heeft.
MoAb-combinaties in Fase-1
De SSC en CD45 intensiteit geven
een eerste indruk van de aanwezige celpopulaties: erytroide (SSClaag/CD45-),
granulocytaire (SSChoog/CD45zwak), monocytaire (SSCintermediair/
CD45intermediair), lymfocytaire (SSClaag/CD45sterk)
en onrijpe cellen (SSCintermediair/CD45zwak). De
relatieve omvang van de gevonden populaties in vergelijking met die in de
normaal populatie is informatief. De aanwezigheid van een omvangrijke onrijpe
celpopulatie in het beenmerg (>20%) met zwakke expressie van CD45 en
positief voor CD34 én CD117, kan passen bij een acute myeloide leukemie,
terwijl een CD34+/CD117- celpopulatie wijst op een onrijpe
populatie, doet vermoeden dat er sprake is van een ALL. Onrijpe lymfatische
cellen zullen echter vaak een lagere SSC vertonen dan de myeloide onrijpe
cellen. Daarnaast kan de CD45 expressie van een precursor-B-ALL t.o.v. normaal
zeer laag of zelfs negatief zijn.
Samenvatting: Onderscheiden van rijpe en onrijpe populaties binnen de
leukocyten en aanwijzing over de aanwezigheid van een toegenomen onrijpe
lymfatische of myeloide celpopulatie, die in de fase-2 verder getypeerd moet
worden.
Monocyten zijn CD36+/CD14+
met hoge FSC terwijl erytroide cellen of trombocyten CD36+/CD14-
zijn met een lagere SSC en FSC. Trombocyten hebben een zeer lage FSC en SSC en
vallen daardoor meestal onder de detectiegrens, tenzij er aggregatie optreedt.
CD13 en CD33 zijn gecombineerd om de vaak zwakke en heterogene expressie van
deze markers te compenseren. CD13 en/of CD33 expressie wordt gezien als
panmyeloide marker, aanwezig op monocytaire of granulocytaire (CD13.33+/CD14-/CD36-)
cellen van onrijp tot rijp.
Samenvatting: Herkenning van monocytaire en erytroide populaties en in
combinatie met FSC en SSC ook granulocyten. Samen met antilichaamcombinatie 1
kan vastgesteld worden of er sprake is van een onrijpe of rijpe myeloide
maligniteit (CD13.33+), die vervolgens in fase-2 (AML) verder moet
worden getypeerd.
T-cellen worden gekarakteriseerd
met CD3. In normaal bloed zijn alleen rijpe T lymfocyten aanwezig (CD5+/CD7+/CD3+)
met een lage FSC en lage SSC. Normale rijpe T-cellen hebben een gemiddelde CD7
expressie. Een zeer sterke expressie van CD7 in een CD5+/CD7+/CD3+
populatie kan wijzen op een T-cel prolymfocyten leukemie. CD5+/CD7+/CD3-
past bij een onrijpe T-cel populatie (T-ALL). Zwakke expressie van CD5 en/of
CD7 op de CD3+ T cellen kan worden gezien bij rijpe
T-celmaligniteiten. Indien dit een populatie betreft met een relatieve omvang
van minimaal 40% van de T-celpopulatie moet een tweede fase uitgevoerd worden.
NK cellen zijn CD5-/CD7+/CD3-. Rijpe B-cellen
kunnen ten dele CD5+/CD7-/CD3- zijn, passend
bij B-CLL en B-NHL.
Samenvatting: Herkennen van rijpe
en onrijpe T-cellen. Onrijpe T-lymfoblasten, normaal niet aanwezig in beenmerg
of bloed, moeten verder getypeerd worden in fase-2 (T-ALL). Voor nadere
informatie over rijpe T-cellen moeten de MoAb-combinatie 4 en 5 worden
geanalyseerd. Aanwezigheid van rijpe B-cellen met alleen CD5+ moet
worden uitgezocht met de MoAb-combinaties 6 en 7.
CD3 is wederom de cellijndefiniërende marker. De CD4/CD8 ratio binnen de CD3+ T-cellen wordt geanalyseerd. In het beenmerg bevinden zich normaliter uit het bloed afkomstige rijpe T-lymfocyten, die deels CD4+ (50-70%) en CD8+ (30-50%) zijn en een klein deel dubbel negatief (voornamelijk TCRgd+ cellen). Onrijpe thymocyten, positief voor CD4 én CD8, komen niet in normaal beenmerg of bloed voor. Een afwijkende CD4/CD8 ratio (< 0,8 of >2,5) kan niet worden gebruikt om de klonaliteit van een populatie aan te tonen, omdat deze ook kan worden gevonden bij reactieve T-celpopulaties (b.v. bij EBV of CMV infecties). Er dient echter wel nader onderzoek te worden gedaan. Dit geldt bij een absolute toename van T-cellen. In het bloed wordt hiervoor een grens van 2x109 /L aangehouden.
Samenvatting: Aantonen van een afwijkende CD4/CD8 ratio binnen CD3+
cellen. In fase-2 (T-cellijn, rijp) dient, na beoordeling van MoAb-combinatie
5, verder te worden uitgezocht of er sprake is van een chronische T-cel
leukemie of “Large granular lymphocyte” leukemie. Een omvangrijke T-celpopulatie, ook met een normale CD4/CD8 ratio, moet
verder worden getypeerd in fase-2 (T-cellijn, rijp).
NK-cellen (CD3-/CD16.56+)
en plasmacellen (CD38sterk) worden geïdentificeerd. De NK-cellen
moeten in samenhang met combinaties 3 en 4 worden beoordeeld. Hoewel CD38 een
niet plasmacelspecifiek MoAb is, blijkt de expressie op plasmacellen zo hoog te
zijn dat CD38 als plasmacelmarker kan worden gebruikt. Indien het relatieve
aantal plasmacellen zeer hoog is (>5%) of positief is voor CD56, kan sprake
zijn van een multipel myeloom. CD56 wordt op het merendeel van de maligne
plasmacelpopulaties gevonden; normale plasmacellen zijn CD56-. Een
nadere typering is dan geïndiceerd. Door CD138 (plasmacellen en (soms)
immunocytoomcellen zijn positief) en CD19 (negatief in multipel myeloom) wordt
aanwezigheid van plasmacellen bevestigd.
Samenvatting: Afwijkende NK-cel populatie leidt tot verdere typering
i.v.m. kans op rijpe T-cellen (“Large granular lymphocyte”
leukemie). Afwijkende plasmacelpopulatie leidt tot verdere typering i.v.m. kans
op multipel myeloom.
MoAb-combinatie 6: SmIgkFITC/SmIglPE/CD19PERCP
of PE-Cy5
De B-cellijn wordt onderzocht op afwijkingen in de k/l ratio binnen de CD19 positieve populatie. Toename van monoklonale B-cellen leidt tot verschuiving van de k/l ratio (normaal 0.9-2.4). Een dergelijke afwijking duidt meestal op een rijpe B-cel maligniteit.
Samenvatting: Vaststellen van monoklonaliteit in de B-celpopulatie. Bij een verschoven k/l ratio moeten de B-lymfocyten verder worden getypeerd in fase-2 (rijpe B-cellijn).
MoAb-combinatie 7: CD10-FITC/CD20-PE/CD19-PERCP of PE-Cy5
Binnen CD19 kunnen in normaal beenmerg met behulp van CD10 en CD20 vier verschillende rijpingsstadia van de B-cellen worden gevonden van zeer onrijpe CD10++/CD20-, via CD10+/CD20-, en CD10+/CD20+, tot de rijpe CD10-/CD20++ B-cel populaties. In normaal beenmerg zijn de onderlinge verhoudingen van deze subpopulaties stabiel met een leeftijdsafhankelijkheid. Tot ongeveer 14 jaar overheersen CD10+ populaties. Bij volwassenen nemen de CD20+ populaties geleidelijk aan toe. Naast verschuivingen in de relatieve frequenties van de verschillende subpopulaties kan in de expressie van CD10 (overexpressie) bij precursor-B ALL variëren. Hierdoor zal de maligne populatie in een CD10/CD20 dotplot in een zogenaamde “empty-space” vallen. Hierin liggen in normaal beenmerg geen cellen. Dit fenomeen wordt gebruikt bij het onderscheiden van normale voorloper-B-cellen (b.v tijdens regeneratie, of na een infectie) van maligne voorloper-B-celpopulaties. Een omvangrijke CD10-/CD20++ populatie kan passen bij een rijpe B-cel maligniteit.
Samenvatting: Vaststellen van afwijkingen in diverse rijpingstadia in de B-cellijn die verder getypeerd worden in fase-2 panels (onrijpe populaties met het precursor B-ALL panel en rijpe populaties met het B-cellijn panel).
Wanneer in de eerste screening
(fase-1) een afwijkende populatie gevonden is, kan een meer specifiek panel van
MoAb-combinaties worden geselecteerd in de fase-2 voor het classificeren van de
verdachte populatie. Bij de keuze van het juiste vervolgpanel is het van belang
dat uit de eerste fase gebleken is of de maligniteit uit onrijpe of rijpe
cellen bestaat en of dat deze zich in de T-, B- of myeloide cellijn
manifesteert. De 3-kleuren MoAb-combinaties in fase-2 bestaan uit zes
maturatie- en cellijn-specifieke panels.
Iedere combinatie in een panel
bevat één marker voor de definiëring van de cellijn: CD19 voor de B-cellijn,
CD3 of CD7 voor de T-cellijn, CD38 voor de plasmacellen en CD13 of CD33 voor de
myeloide cellijn. De andere twee markers worden gebruikt voor: 1. de differentiatie en rijping, 2. het
uitsluiten van celpopulaties die markers met elkaar gemeen hebben, 3. het typeren van subpopulaties binnen de afwijkende populatie en 4. vaststellen van aberrante expressie. Bij
de onrijpe maligniteiten zijn bovendien de combinaties (MPO/CyCD79a/CyCD3) en
(TdT/CD5/CD19) opgenomen ter bevestiging van enerzijds myelo-monocytaire (MPO+),
de B-cel- (CyCD79a+) of de T-cel- (CyCD3+) lijn en anderzijds
precursor B- (TdT/CD19+) en T- (TdT/CD5+) cellen. Bij
onrijpe celpopulaties is het marker-expressiepatroon op de celmembraan niet
altijd voldoende informatief en zijn deze intracellulaire kleuringen nodig om
de cellijn definitief vast te stellen.
De 3
panels voor onrijpe maligniteiten en 3 panels voor rijpe maligniteiten zijn als
volgt samengesteld:
Panels voor onrijpe
maligniteiten:
Panels voor rijpe
maligniteiten:
Samenvatting: De in fase-1 gevonden afwijkende celpopulatie wordt verder getypeerd met één van de zes panels van fase-2, waarbij de panel keuze afhankelijk is van de cellijn en rijpheid van de afwijkende cellen.
Literatuur
1. P Lucio, A Parreira,
MWM van den Beemd, EG van Lochem, ER van Wering, E Baars, A Porwit- MacDonald,
E Bjoklund, G Gaipa, A Biondi, A Orfao, G Janossy, JJM van Dongen, JF San
Miguel. Flow cytometric analysis of normal B cell
differentiation: a frame of reference for the detection of minimal residual
disease in precursor-B-ALL. Leukemia 1999 13: 419-427
2. A Porwit-MacDonald, E
Bjorkland, EG van Lochem, J Mazur, A Parreira, MWM van den Beemd, ER van
Wering, E Baars, G Gaipa, A Biondi, J Ciudad, JJM van Dongen, JF San Miguel, A
Orfao. BIOMED-1 Concerted Action report: Flow cytometric
characterization of CD7+ cell subsets in normal bone marrow as a basis for the
diagnosis and follow-up of T cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). Leukemia 2000
14:816-825
3. P Lucio, G Gaipa, EG
van Lochem, ER van Wering, A Porwit- MacDonald, T Faria, E Bjoklund, A Biondi,
MWM van den Beemd, E Baars, B Vidriales, A Parreira, JJM van Dongen, JF San
Miguel, A Orfao. BIOMED-1 concerted action report: flow cytometric
immunophenotyping of precursor B-ALL with standardized triple-stainings. Leukemia 2001
15:1185-1192
4. JJM van Dongen, HJ
Adriaansen, EG van Lochem, H Hooijkaas. Flowcytometrisch immunofenotyperen van
leukemieen en lymfomen. In: Flowcytometrische immunodiagnostiek: nieuwe
ontwikkelingen en hun toepassingen, hoofdstuk 13; ISBN 90-73436-46-X, 1998.
5. CD Jennings, KA Foon. Recent advances in flow cytometry: application to
the diagnosis of hematologic malignancy. Blood 1997 90:2863-2892
6. Groeneveld
K, te Marvelde JG, van den Beemd MW, Hooijkaas H, van Dongen JJ. Flow cytometric detection of intracellular antigens
for immunophenotyping of normal and malignant leukocytes. Leukemia. 1996; 10:
1383-1389.
Tabel 2. Procedures
voor drie-kleuren labelingen van intracellulaire en/of celmembraangebonden
markers in vol beenmerg of vol bloed
|
1. Lyseren van benodigde hoeveelheid vol beenmerg of vol bloed met 50 ml NH4Cl (10 min kT) 2. Wassen met 50 ml PBS (pH 7.8) 0.5% (w/v) BSA 3. Pellet opnemen in benodigd volume 4. Incubatie van 50 µl celsuspensie met 25 µl van elke celmembraangebonden marker (10 min kT) |
||
|
5. Intracellulaire marker TdT in combinatie met twee membraangebonden markers |
5. Intracellulaire markers (CyCD3 of MPO) in combinatie met 1 (of 2) membraangebonden markers |
5. Drie membraan-gebonden markers |
|
6. Toevoegen 2 ml (1:10) FACS Brand Lysing Solution (10 min kT) |
6. Wassen |
6. Wassen |
|
7. Centrifugeren |
7. Toevoegen van 100 µl reagens Aa (15 min kT) |
|
|
8. Wassen |
8. Wassen |
|
|
9. Incubatie met 25 µl TdT-FITC (10min kT) |
9. Toevoegen van 100 µl reagens Ba en 25 µl van elke cytoplasmatische marker |
|
|
10. Wassen |
10. Wassen |
|
a. Separate fixatie- en permeabilisatievloeistoffen (Fix en Perm, An der Grub, Wenen, Oostenrijk; Intraprep, Immunotech, Marseille, Frankrijk) blijken effectief voor een optimale kleuring van bijvoorbeeld CyCD3 van MPO6.
