Stichting Immunofenotypering Hemato-Oncologie Nederland (SIHON)

 

Algemene kwaliteitsrichtlijn

voor laboratoria die immuunfenotypering van hematologische maligniteiten verrichten

 

Inleiding

 

Ontwikkeling van SIHON

 

In 1985 is het Samenwerkingsverband Immunofenotypering Hemato1ogische Oncologie in Nederland (SIHON) opgericht met als doel het standaardiseren en verbeteren van de immunofenotypering van hematologische maligniteiten (acute en chronische leukemieŽn en lymfomen). De eerste jaren bestond dit samenwerkingsverband uit twee werkgroepen: (i) een "cytologie" werkgroep bestaande uit immunologische en hematologische laboratoria die typering van cellen in suspensie zoals bloed, beenmerg, liquor cerebrospinalis, pleuravocht, ascites of weefselpunctaten verrichtten en (ii) een "pathologie" werkgroep gevormd door pathologisch-anatomische laboratoria voor immunohistochemische typering van weefsels. Na een aantal jaren is de pathologiewerkgroep afgesplitst. De cytologiewerkgroep heeft zich uitgebreid en vertegenwoordigt inmiddels vrijwel alle laboratoria in Nederland en de meerderheid in Vlaamstalig BelgiŽ die zich actief bezig houden met immunofenotypering van leukemieŽn en lymfomen. In eerste instantie namen vooral de hematologische en immunologisch gespecialiseerde laboratoria van de academische en grotere perifere ziekenhuizen deel. De laaste jaren zijn ookklinisch chemische laboratoria gaan deelnemen. Voor bijna alle laboratoria geldt dat immunofenotypering van leukemieŽn en lymfomen onderdeel is van hun diagnostisch pakket. In 1992 is de organisatievorm van SIHON gewijzigd in ďStichting Immunofenotypering Hematologische Oncologie Nederland.Ē In de statuten en huishoudelijk reglement van deze stichting staan de doelstelling, werkwijze en bestuursamenstelling beschreven.

 

Werkterrein van SIHON

 

SIHON organiseert halfjaarlijks rondzendingen van drie verse geanonymiseerde bloedmonsters met bijbehorende uitstrijkjes en een hematologische vraagstelling. Gestreefd wordt naar een gelijkmatige verdeling van de rondzendingen over het jaar verspreid met uitzondering van de vakantieperioden. Er worden oriŽnterende klinische gegevens verstrekt, aan de hand waarvan een deelnemer moet beslissen welk panel van monoklonale antilichamen gebruikt dient te worden om tot een juiste classificerende diagnose te komen. Door de ďNomenclatuurcommissieĒ van SIHONĒ) zijn voor de immunotypering van de verschillende hematologische maligniteiten richtlijnen opgesteld, waarin de merkers gedefinieerd zijn die voor het beantwoorden van de vraagstellingen bepaald dienen te worden. De deelnemers moeten voor de rapportage van de resultaten de in 2000 ontwikkelde standaardformulieren gebruiken. Hierop dient, naast een analyse van de afwijkende celpopulatie in het monster (% afwijkende cellen, merkerprofiel [per merker: % binnen de afwijkende populatie en intensiteit van expressie] en de cellijn waarin afwijkende celpopulatie zich bevindt), ook een evaluatie gegeven te worden van de overige aanwezige celpopulaties in de vorm van een immunologische differentiatie. Tweemaal per jaar vindt een plenaire bespreking van de resultaten plaats. Deze vergadering is informeel om een open discussie over de resultaten aan te moedigen.Voor de beoordeling van de resultaten van de deelnemers is een uniek scoringssysteem ontwikkeld waarmee kan worden aangegeven of de deelnemer de juiste antistoffen heeft gebruikt, de juiste reactiviteitheeft gevonden en de juiste immunologische conclusie heeft getrokken. De beoordeling van de pre- en post-analytische fasen door de leden van de Nomenclatuurcommissie geschiedt op basis van de eerder genoemde SIHON-richtlijnen. Voor de beoordeling van de analytische fase wordt per merker het resultaat van de meerderheid van de deelnemende laboratoria als referentiewaarde voor de betreffende merker gebruikt.

 

Tijdens de plenaire SIHON-vergaderingen vindt tevens een scholing op het gebied van de immunofenotypering plaats d.m.v. presentaties van gastsprekers en SIHON-leden. Daarnaast zijn er voordrachten van leden van de verschillende SIHON-werkgroepen overde vorderingen binnen de betreffende werkgroep. Een verslag van de rondzending wordt aan de deelnemers gezonden en geanonimiseerd op de SIHON website gepubliceerd (www.sihon.nl). Scholing wordt tevens verzorgd door de regelmatig door SIHON georganiseerde symposia op het gebied van immunofenotypering en flowcytometrie.

De SIHON werkgroep ďKwaliteitĒ heeft in 1996, dankzij de gezamenlijke inspanning van de meeste SIHON-deelnemers, een ďSoppenboekĒsamengesteld. In dit boek zijn volgens de praktijkrichtlijnen van de Centrale Commissie voor Kwaliteitsbewaking van Laboratoria (CCKL) ďstandard operating proceduresĒ geschreven voor alle bepalingen en reagentia gebruikt bij de immunofenotypering van hematologische maligniteiten. De overtuiging van de werkgroep is dat, indien volgens deze methoden wordt gewerkt, de bepalingen betrouwbare resultaten zullen opleveren. Dit laat onverlet dat dat een laboratorium vrij is om de bepalingen aan de lokale omstandigheden of voorkeuren aan te passen; het is echter wenselijk dat zulke modificaties niet tot suboptimale of zelfs foutieve resultaten leiden; dit wordt getoetst in het externe kwaliteitsbewakings-programma van SIHON.

 

De Nomenclatuurcommissie heeft richtlijnen en protocollen voor immunologische classificaties opgesteld en actualiseert deze regelmatig (zie boven).

 

De werkgroep ďFlowcytometrieĒ is gericht op het evalueren en, bij gebleken geschiktheid, introduceren van nieuwe flowcytometrische technieken op het gebied van leukemie/lymfoomtypering. De Nomenclatuurcommissie heeft in samenwerking met de werkgroep Flowcytometrie als richtlijn protocollen voor 3-kleuren immunofenotypering in de vorm van panels van antilichamen en fluorochromen samengesteld. Hierin wordt een immunofenotypische bepaling uitgevoerd in twee fasen: een oriŽnterende screeningsfase, waarbij de cellijn van de maligniteit wordt vastgesteld, en een cellijn-specifieke fase die toegespitst is op de gedetailleerde typering van maligniteit. Deze protocollen zijn gepubliceerd op de SIHON website.
Algemene kwaliteitsrichtlijn

 

Zoals hierboven vermeld is de immuunfenotypering van leukemieŽn en lymfomen meestal een onderdeel van meer algemeen diagnostisch programma binnen een laboratorium, waarbij de inhoud van de andere diagnostische gebieden sterk kan uiteenlopen tussen de verschillende laboratoria. Er is ook geen vaste koppeling met een specifieke beroepsgroep. De SIHON heeft daarom een kwaliteitsrichtlijn opgesteld die kan dienen als handleiding voor een auditor bij de beoordeling van een laboratorium dat immunofenotypering van hematologische maligniteiten verricht. Hierbij heeft de SIHON zich beperkt tot vakinhoudelijke criteria, en gaat ervan uit dat het geauditeerde laboratorium werkt volgens een kwaliteitssysteem zoals omschreven in bijv. de CCKL praktijkrichtlijn.

 

Kwalificatie en training van personeel

 

De persoon die de eindverantwoording draagt voor de immunodiagnostiek van leukemieŽn en lymfomen dient een academicus te zijn met een gerichte post-academische opleiding ([medisch] immunoloog, klinisch chemicus, arts met specifieke vervolgopleiding). Deze eis moet waarborgen dat de eindverantwoordelijke over voldoende kennis beschikt om de uitslagen in hun klinische context te kunnen plaatsen, hierover met de aanvragend arts te kunnen overleggen, en de technische kwaliteit van de bepalingen te kunnen waarborgen.Het laboratorium behoort tevens te beschikken over voldoende kennis op het gebied van morfologie van bloed en beenmerg ter vergelijking van de resultaten van immunofenotypering in situ. De kennis op deze terreinen wordt door voortdurende nascholing actueel gehouden. Dergelijke nascholing bestaat uit (i) het bijhouden van vakliteratuur d.m.v. tijdschriften (bijvoorbeeld Blood, Leukemia, British Journal ofHaematology, [Clinical] Cytometry en AmericanJournal of Pathology), (ii) het jaarlijks deelnemen aan tenminste ťťn congres op het vakgebied, en (iii) het deelnemen aan de door SIHON georganiseerde vergaderingen en symposia. Regelmatig multidisciplinair overleg met de specialisten welke betrokken zijn bij de diagnostiek en behandeling van patiŽnten met hematologische maligniteiten dient ertoe bij te dragen dat de immunofenotyperingsdiagnostiek voldoende is ingebed in de medische praktijk.

 

De analist welke verantwoordelijk is voor de uitvoering van de laboratorium-werkzaamheden dienen Hoger Laboratorium Onderwijs (HLO) of een gelijkwaardige opleiding te hebben gevolgd, en over aanwijsbare kennis en ervaring op het gebied van de immunologie te beschikken. Ook hij/zij dient zijn/haar vakkennis actueel te houden door (i) het deelnemen aan de door SIHON georganiseerde vergaderingen en symposia, en (ii) door het lezen van de door de eindverantwoordelijke academicus aangereikte vakliteratuur.

 

De analisten die de praktische laboratoriumwerkzaamheden uitvoeren dienen minimaal Middelbaar Laboratorium Onderwijs of gelijkwaardig te hebben afgerond, aangevuld met cursussen op het gebied van immunofenotypering. Gezien de aard en complexiteit van het scala aan werkzaamheden, met name de flowcytometrische data-analyse, moeten deze analisten qua kennis en werkniveau op HLO niveau kunnen functioneren.
Apparatuur

 

In de beginjaren van de immuunfenotypering van leukemieŽn en lymfomen (vůůr 1990) waren de technieken veelal gebaseerd op 1 of, incidenteel, 2-kleuren immuunfluorescentie-microscopie. Op het moment van schrijven (2004) is meerkleuren flowcytometrie de algemene standaard. Voor het verrichten van immunodiagnostiek van hematologische maligniteiten dient het laboratorium daarom te beschikken over een flowcytometer. Met deze apparatuur dient minimaal 2-kleuren fluorescentie te kunnen worden beoordeeld. Calibratie en onderhoud van het instrument dienen te worden bijgehouden in een logboek.

 

Alhoewel intracellulaire expressie van merkers flowcytometrisch te bepalen is, kan het in sommige gevallen nodig zijn om het karakteristieke patroon van de intracellulaire fluorescentie in de beoordeling te betrekken. Ook moet ďsatellitismeĒ van thrombocyten kunnen worden uitgesloten. Hiertoe dient het laboratorium te kunnen beschikken over een fluorescentiemicroscoop, en moet er de mogelijkheid zijn tot het maken van cytospinpreparaten.

 

Voor de beoordeling van de morfologie van de cellen dient het laboratorium te beschikken over een lichtmicroscoop.

 

Bepalingen

 

Het laboratorium dient in staat te zijn tot het verrichten van immunofenotypische analyse van hematologische cellen (membraanmarkers zowel als cytoplasmatische markers) in de routinematig aangeboden monsters van patiŽnten zoals bloed, beenmerg, lymfklierbiopten en liquor cerebrospinalis.

 

Bij het immunofenotyperen van een hematologische maligniteit dient het laboratorium uit te gaan van de door SIHON geadviseerde panels van cellijndefiniŽrende merkers en merkers welke gedetailleerde typering binnen de cellijnen mogelijk maken. Indien het laboratorium niet over een volledig panel van (monoclonale) antistoffen beschikt,dient per uitslag te worden beoordeeld in hoeverre een immunologische conclusie volgens de SIHON richtlijn mogelijk is. Deze panels en de richtlijnen voor interpretatie zijn gepubliceerd op de SIHON website en worden regelmatig geactualiseerd. Dit laatste wordt uitgevoerd door de Nomenclatuurcommissie onder eindverantwoordelijkheid van het SIHON bestuur.

 

Bij voorkeur dienen de immunofenotypische bepalingen vergezeld te gaan van een morfologische beoordeling van een gekleurd preparaat. Indien dit niet het geval is moet bij de uitslag duidelijk worden vermeld dat het om een uitsluitend immunologische diagnose gaat. Bij voorkeur moet deze uitslag pas opgesteld worden na overleg met de beoordelaar van de celmorfologie en eventuele cytochemische kleuringen.
Interne en externe kwaliteitsbewaking

 

Het laboratorium dient procedures voor interne kwaliteitsbewaking te hebben geformuleerd en geÔmplementeerd overeenkomstig met de CCKL-richtlijnen. Dit betreft de procedures van de leukemie/lymfoom immunofenotypering in zijn geheel alsook kwaliteitscontroles op alle voor de immunofenotypering relevante onderdelen (bijv. titratie van monoclonale antistoffen afzonderlijk als ook in meer-kleuren panels; controle op verval van reagentia; calibratie van de apparatuur als ook validatie van de van toepassing zijnde methodieken en de rapportage van resultaten).

 

Voor externe kwaliteitsbewaking dient het laboratorium deel te nemen aan de rondzendingen georganiseerd door SIHON. Indien bij deze rondzendingen op onderdelen onvoldoende resultaten worden geboekt (geclassificeerd als ďCĒ) dient een intern verbeterproces te worden uitgevoerd en de resultaten daarvan te worden gedocumenteerd.